RRBS揭示基于DNA甲基化驱动基因的肾透明细胞癌预后的鉴定

肾细胞癌（RCC）是最常见的肾癌亚型，每年超400万例新发病例，是泌尿系统恶性肿瘤导致的第二大死因。2%-70%的RCC为透明细胞RCC（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。DNA甲基化（DNA methylation，DNAm）是主要的表观遗传修饰之一，在维持基因转录和基因组稳定性方面具有至关重要的作用。DNAm在ccRCC的发病机制中起着重要作用，许多研究集中于DNAm异常变化与ccRCC预后之间的相关性，但基于DNAm驱动基因的ccRCC预后模型鲜有报道。

2023年6月7日，南方医科大学附属龙华人民医院泌尿外科邓琼研究员等在《BMC Genomics》发表题为“Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma“的研究论文，该研究以ccRCC患者的DNA为对象，通过简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）等技术方法，鉴定出ccRCC患者的ccRCC早期诊断和预后的DNA甲基化生物标志物。

标题：Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma（基于DNA甲基化驱动基因的肾透明细胞癌预后模型的鉴定和验证）

时间：2023-06-07

期刊：BMC Genomics

影响因子：IF 4.4

技术平台：RRBS等

摘要：

肾透明细胞癌（ccRCC）是一种形态异质且预后不良的恶性肿瘤。本研究旨在建立DNA甲基化（DNAm）驱动的ccRCC基因预后模型。本研究对ccRCC患者的DNA提取物进行了RRBS测序分析。对10对患者样本的RRBS数据进行分析以筛选候选CpG位点，然后训练并验证18个CpG位点模型，并结合临床特征建立了用于ccRCC预后或风险评估的列线图（Nomogram model）模型。研究在启动子区域鉴定出2261个DMR。经DMR筛选后，共筛选出578个候选基因，与450K芯片中的408个CpG二核苷酸相对应。从TCGA数据集中收集了478个ccRCC样本的DNAm图谱。通过单因素Cox回归、LASSO回归和多因素Cox比例风险回归分析对319个样本的training集进行分析，共鉴定出18个CpG的预后组。结合临床特征构建了预后模型，在测试集（test set，159个样本）和整组（whole set，478个样本）中，Kaplan-Meier曲线差异显著；ROC曲线和生存分析显示AUC＞0.7。结合临床病理特征和甲基化风险评分的列线图表现较好，决策曲线分析也显示出有益的效果。

本研究深入了解了高甲基化在ccRCC中的作用。鉴定出的靶标可作为ccRCC早期诊断和预后判断的生物标志物。本研究对更好的风险分层和个性化治疗具有重要意义。

研究结果

（1）RRBS质控结果

表3：C和CpG位点甲基化和比对

表4：CG、CHG、CHH平均甲基化水平（;1X深度）

图1：样本间全基因组甲基化差异。

样本中CpG甲基化水平相关性。较大的圆形区域和较深的颜色表示高相关性。

聚类树状图。根据欧几里得距离，使用R.Ward.d2的hclust函数对样本进行聚类。选择最小方差方法作为聚类方法

（2）DMR鉴定

图2：DMR分析

平均甲基化差异。X轴代表甲基化差异。负值表示低甲基化。正值表示高甲基化。Y轴表示相应横坐标的DMR数量。

DMR甲基化分布密度。X轴代表Ca组中的DMR甲基化水平；Y轴代表对照组中的DMR甲基化水平。DMR密度从低到高（白色到红色）。

DMR在基因元件上的分布

（3）ccRCC预后模型构建

图3：差异甲基化CpG（differentially methylated CpG，dmCpG）位点鉴定。

A、 使用调谐参数（lambda）对CpG位点进行LASSO回归分析。

B、 蛋白质-蛋白质互作。

C、 18个dmCpG位点的DisGeNet疾病富集分析。

D、 18个dmCpG位点的GO富集分析

表5：预后模型中18个CpG位点的注释

（4）预后模型的Training

图4：training集中的风险评分

高风险组和低风险组患者的KM生存曲线。数据显示为四分位间距的中位数。使用Log-rank检验评估统计学显著性。虚线显示50%生存概率的显著性。

计算高风险和低风险患者的风险评分和生存状态等级。虚线显示区分ccRCC高风险和低风险患者的临界值。

C.18个CpG位点甲基化水平热图。

风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线。以临界值决定该模型的敏感性和特异性

图5：test集中的风险评分

（5）预后模型的验证

图6：基于预后模型和临床特征的列线图

预后模型和临床特征的单因素（A）和多因素（B）回归分析。（C）预测ccRCC患者1年、3年、5年和10年生存时间概率列线图

图7：模型校准和ROC评估

高风险组和低风险组患者的KM生存曲线。

预测ccRCC患者1年、3年、5年和10年总生存期（OS）的列线图。

C-F. 1年（C）、3年（D）、5年（E）、10年（F）的临床病理特征（绿色，与肿瘤分期诊断、年龄和肿瘤组织学分级相结合），RiskScore（红色）和NomoScore（黑色）的ROC曲线

结论

本研究分析了患者样本中的RRBS数据以筛选原始候选CpG位点，然后利用TCGA-KIRC数据训练和验证了18个CpG位点模型，并结合临床特征建立了用于ccRCC预后或风险评估的列线图模型。

基于该结果，研究开发并验证了这种新型预后模型是一种实用、可靠的ccRCC患者预后工具。本研究结果支持异常DNAm变化与肿瘤发生密切相关的观点，并为ccRCC提供了潜在的新型预后生物标志物，对更好的风险分层和个性化治疗具有重要意义。

参考文献：

Deng Q, Du Y, Wang Z, Chen Y, Wang J, Liang H, Zhang D. Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma. BMC Genomics. 2023 Jun 7;24(1):307.